ČESKÁ TECHNICKÁ NORMA

ICS 65.120                                                                                                                                   Listopad 2023

Krmiva – Metody vzorkování a analýz – Stanovení pyrrolizidinových alkaloidů v krmivech pomocí LC‑MS/MS

ČSN EN 17683 46 7069

 

Animal feeding stuffs – Methods of sampling and analysis – Determination of pyrrolizidine alkaloids in animal feeding stuff by LC-MS/MS

Alimentation animale – Méthodes d’échantillonnage et d’analyse – Dosage des alcaloïdes pyrrolizidiniques dans l’alimentation animale par CL-SM/SM

Futtermittel – Probenahme- und Untersuchungsverfahren – Bestimmung von Pyrrolizidinalkaloiden in Futtermitteln mittels LC-MSMS

Tato norma je českou verzí evropské normy EN 17683:2023. Překlad byl zajištěn Českou agenturou pro standardizaci. Má stejný status jako oficiální verze.

This standard is the Czech version of the European Standard EN 17683:2023. It was translated by the Czech Standardization Agency. It has the same status as the official version.

 

Národní předmluva

Informace o citovaných dokumentech

EN ISO 3696 zavedena v ČSN ISO 3696 (68 4051) Jakost vody pro analytické účely. Specifikace a zkušební metody

Souvisící ČSN

ČSN ISO 5725-2 (01 0251) Přesnost (pravdivost a preciznost) metod a výsledků měření – Část 2: Základní metoda pro stanovení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti normalizované metody měření

ČSN ISO 5725-3 (01 0251) Přesnost (pravdivost a preciznost) metod a výsledků měření – Část 3: Mezilehlé míry preciznosti normalizované metody měření

Souvisící předpisy

Nařízení Komise (EU) 2020/2040 ze dne 11. prosince 2020, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, pokud jde o maximální limity pyrrolizidinových alkaloidů v některých potravinách

Nařízení Komise (ES) č. 401/2006 ze dne 23. února 2006, kterým se stanoví metody odběru vzorků a metody analýzy pro úřední kontrolu množství mykotoxinů v potravinách

Vypracování normy

Zpracovatel: Kateřina Šléglová, IČO 76130509

Pracovník České agentury pro standardizaci: Ing. Radmila Foretová

Česká agentura pro standardizaci je státní příspěvková organizace zřízená Úřadem pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví na základě ustanovení § 5 odst. 2 zákona č. 22/1997 Sb., o technických požadavcích na výrobky a o změně a doplnění některých zákonů, ve znění pozdějších předpisů.

ICS 65.120                                                                                                                                                     

Krmiva – Metody vzorkování a analýz – Stanovení pyrrolizidinových alkaloidů v krmivech pomocí LC-MS/MS

Animal feeding stuffs – Methods of sampling and analysis – Determination of pyrrolizidine alkaloids in animal feeding stuff by LC-MS/MS

Tato evropská norma byla schválena CEN dne 2023-01-17.

Členové CEN jsou povinni splnit vnitřní předpisy CEN/CENELEC, v nichž jsou stanoveny podmínky, za kterých se této evropské normě bez jakýchkoliv modifikací uděluje status národní normy. Aktualizované seznamy a biblio-
grafické citace týkající se těchto národních norem lze obdržet na vyžádání v Řídicím centru CEN-CENELEC nebo u kteréhokoliv člena CEN.

Tato evropská norma existuje ve třech oficiálních verzích (anglické, francouzské, německé). Verze v každém jiném jazyce přeložená členem CEN do jeho vlastního jazyka, za kterou zodpovídá a kterou notifikuje Řídicímu centru CEN-CENELEC, má stejný status jako oficiální verze.

Členy CEN jsou národní normalizační orgány Belgie, Bulharska, České republiky, Dánska, Estonska, Finska, Francie, Chorvatska, Irska, Islandu, Itálie, Kypru, Litvy, Lotyšska, Lucemburska, Maďarska, Malty, Německa,
Nizozemska, Norska, Polska, Portugalska, Rakouska, Republiky Severní Makedonie, Rumunska, Řecka, Slovenska, Slovinska, Spojeného království, Srbska, Španělska, Švédska, Švýcarska a Turecka.

 

Obsah

Strana

Evropská předmluva.................................................................................................................................................................................... 6

Úvod................................................................................................................................................................................................................ 7

1......... Předmět normy................................................................................................................................................................................ 8

2......... Citované dokumenty....................................................................................................................................................................... 9

3......... Termíny a definice........................................................................................................................................................................... 9

4......... Princip................................................................................................................................................................................................ 9

4.1...... Obecně.............................................................................................................................................................................................. 9

4.2...... Činidla................................................................................................................................................................................................ 9

4.3...... Analytické standardy....................................................................................................................................................................... 9

4.4...... Chemikálie..................................................................................................................................................................................... 10

4.5...... Roztoky............................................................................................................................................................................................ 11

4.5.1... Extrakční vodný roztok 0,05mol/l kyseliny sírové.................................................................................................................... 11

4.5.2... Vodný roztok amoniaku (20/80) (v/v) pro neutralizaci extraktů před SPE.......................................................................... 11

4.5.3... Příklady mobilních fází HPLC..................................................................................................................................................... 11

4.5.4... Zásobní roztoky PA....................................................................................................................................................................... 11

4.5.5... Standardní pracovní roztok (směs PA), 1 µg/ml...................................................................................................................... 11

5......... Přístroje........................................................................................................................................................................................... 11

5.1...... Různé pístové pipety a vícenásobné dávkovače a příslušné špičky................................................................................... 11

5.2...... Analytické váhy, schopné vážit s přesností na 0,1 mg........................................................................................................... 11

5.3...... Policová sušárna........................................................................................................................................................................... 11

5.4...... Centrifugační mlýnek se sítem 0,5 mm.................................................................................................................................... 12

5.5...... Centrifuga na 50ml centrifugační zkumavky, s výkonem nejméně 5 000 g..................................................................... 12

5.6...... Laboratorní třepačka..................................................................................................................................................................... 12

5.7...... Překlopná třepačka....................................................................................................................................................................... 12

5.8...... Odpařovací stanice s podporou nebo bez podpory vakua.................................................................................................... 12

5.9...... Ultrazvuková lázeň........................................................................................................................................................................ 12

5.10.... Centrifugační zkumavky 50 ml................................................................................................................................................... 12

5.11.... Zkušební zkumavky 15 ml........................................................................................................................................................... 12

5.12.... Odměrné baňky, 10 ml a 20 ml.................................................................................................................................................. 12

5.13.... Skládané filtry................................................................................................................................................................................ 12

5.14.... SPE kolonky: C18, 500 mg sorbentu......................................................................................................................................... 12

5.15.... pH indikátorové papírky............................................................................................................................................................... 12

5.16.... SPE vakuová komora................................................................................................................................................................... 12

5.17.... Membránový filtr 0,2 µm nebo 0,45 µm.................................................................................................................................... 12

5.18.... HPLC vialky 2 ml........................................................................................................................................................................... 12

5.19.... Skleněné vložky, 250 µl kónické pro HPLC vialky.................................................................................................................. 12

5.20.... Chromatografická kolona............................................................................................................................................................ 12

5.21.... LC-MS/MS systém......................................................................................................................................................................... 12

6......... Postup.............................................................................................................................................................................................. 12

6.1...... Obecně............................................................................................................................................................................................ 12

6.2...... Příprava vzorku.............................................................................................................................................................................. 13

6.3...... Extrakce........................................................................................................................................................................................... 13

Strana

6.4...... Postup SPE..................................................................................................................................................................................... 14

6.5...... Rekonstituce vzorku...................................................................................................................................................................... 14

6.6...... Vzorky pro kontrolu kvality........................................................................................................................................................... 14

6.7...... Kalibrace pomocí přizpůsobených matricových standardů (MMS)..................................................................................... 14

7......... HPLC-MS/MS analýza.................................................................................................................................................................. 15

7.1...... Separace kapalinovou chromatografií...................................................................................................................................... 15

7.2...... Provozní podmínky hmotnostní spektrometrie........................................................................................................................ 15

7.3...... Analytická sekvence..................................................................................................................................................................... 16

8......... Výsledky.......................................................................................................................................................................................... 16

8.1...... Identifikace píku............................................................................................................................................................................. 16

8.2...... Kalibrační funkce........................................................................................................................................................................... 16

8.3...... Kvantifikace.................................................................................................................................................................................... 16

8.4...... Uvádění výsledků.......................................................................................................................................................................... 17

8.5...... Kontrola kvality – kritéria výkonnosti.......................................................................................................................................... 17

9......... Preciznost....................................................................................................................................................................................... 17

9.1...... Obecně............................................................................................................................................................................................ 17

9.2...... Opakovatelnost.............................................................................................................................................................................. 17

9.3...... Reprodukovatelnost...................................................................................................................................................................... 18

10....... Protokol o zkoušce........................................................................................................................................................................ 18

Příloha A (informativní) Data preciznosti.............................................................................................................................................. 19

Příloha B (informativní) Příklad podmínek LC-MS/MS....................................................................................................................... 51

Příloha C (informativní) Příklad LC-MS/MS chromatogramu směsi pyrrolizidinových alkaloidů.............................................. 54

Příloha D (informativní) Protokol metody pro stanovení pyrrolizidinových alkaloidů v krmivech pomocí LC‑MS/MS
po redukci N-oxidů s využitím kovového zinku........................................................................................................................ 55

Příloha E (informativní) Seznam potenciálně koeluujících izomerů pyrrolizidinových alkaloidů (PA)..................................... 64

Bibliografie.................................................................................................................................................................................................. 65

 

 

Evropská předmluva

Tento dokument (EN 17683:2023) vypracovala technická komise CEN/TC 327 Krmiva – Metody odběru vzorků a analýzy, jejíž sekretariát zajišťuje NEN.

Této evropské normě je nutno nejpozději do září 2023 udělit status národní normy, a to buď vydáním identického textu, nebo schválením k přímému používání, a národní normy, které jsou s ní v rozporu, je nutno zrušit nejpozději do září 2023.

Upozorňuje se na možnost, že některé prvky tohoto dokumentu mohou být předmětem patentových práv. CEN nelze činit odpovědným za identifikaci jakéhokoliv nebo všech patentových práv.

Tento dokument byl vypracován na základě normalizačního požadavku uděleného CEN Evropskou komisí
a Evropským sdružením volného obchodu.

Jakákoli zpětná vazba a otázky týkající se tohoto dokumentu mají být adresovány národnímu normalizačnímu orgánu uživatele. Úplný seznam těchto orgánů lze nalézt na webových stránkách CEN.

Podle vnitřních předpisů CEN-CENELEC jsou tuto evropskou normu povinny zavést národní normalizační organizace následujících zemí: Belgie, Bulharska, České republiky, Dánska, Estonska, Finska, Francie, Chorvatska, Irska, Islandu, Itálie, Kypru, Litvy, Lotyšska, Lucemburska, Maďarska, Malty, Německa, Nizozemska, Norska, Polska, Portugalska, Rakouska, Republiky Severní Makedonie, Rumunska, Řecka, Slovenska, Slovinska, Spojeného království, Srbska, Španělska, Švédska, Švýcarska a Turecka.

Úvod

Pyrrolizidinové alkaloidy (PA) jsou sekundární metabolity kvetoucích rostlin. Požití vyšších dávek vede k akutnímu poškození jater. Při studiích na zvířatech bylo prokázáno, že některé PA jsou genotoxické karcinogeny. Proto jsou PA v potravinách a krmivech nežádoucími látkami [1], [2]. Otravy u zvířat byly doloženy v případech připsaných rodům Heliotropium, Trichodesma, Senecio a Crotalaria. Pasoucí se zvířata se obvykle rostlinám obsahujícím PA vyhýbají. Avšak jsou-li plevelné rostliny využity pro produkci sena, siláže nebo jiných krmných surovin rostlinného původu, zvířata již nemají možnost se jim při krmení vyhnout, protože toxiny přečkají skladování a jsou zcela promíchány s krmivem. Proto je potřebná analytická metoda pro kontrolu úrovní PA v krmivech [1], [2]. Tento dokument popisuje metody vzorkování a analýzy pro stanovení pyrrolizidinových alkaloidů v krmivech
pomocí LC-MS/MS.

Metoda byla úspěšně validována ve společné zkoušce pro matrice kompletní krmivo pro koně, doplňkové krmivo pro koně, doplňkové krmivo pro hlodavce, seno, vojtěšku a travní siláž. Validace byla provedena pro PA a rozsahy koncentrací popsané v kapitole 1. Ukázalo se, že izomerní páry PA senecivernin a senecionin, stejně jako senecivernin-N-oxid a senecionin-N-oxid nelze stanovit jednotlivě z důvodu nedostatečné chromatografické separace. Součty jednotlivých PA izomerních párů však byly kvantifikovány s dostatečnou reprodukovatelností. Je třeba vzít v úvahu koeluci dalších izomerů PA, které nejsou zahrnuty do rozsahu metody. Seznam potenciálně koelutujících izomerů je uveden v nařízení Komise (EU) č. 2020/2040 [3].

Ačkoli je kalibrační rozsah protokolu metody specifikován od 10 µg/kg do 300 µg/kg, výsledky společné studie ukázaly, že ředění extraktů vzorků extrakty slepých vzorků umožňuje kvantifikaci koncentrací přesahujících
kalibrační rozsah. Uspokojivé reprodukovatelnosti bylo dosaženo při kvantifikaci až do 1 428 µg/kg pro jednotlivé PA a až do 887 µg/kg pro sumu izomerních párů.

UPOZORNĚNÍ – Používání tohoto protokolu může být spojeno s používáním nebezpečných materiálů, pracovních postupů a zařízení. Tento protokol adresně neupozorňuje na všechny bezpečnostní problémy spojené s jeho použitím. Je odpovědností uživatele tohoto protokolu, aby před použitím stanovil vhodné zdravotní a bezpečnostní postupy a určil jejich kompatibilitu s regulatorními omezeními.

1 Předmět normy

Tento dokument specifikuje metodu pro kvantitativní stanovení pyrrolizidinových alkaloidů (PA) v koncentračních rozsazích uvedených v tabulce 1 v kompletních, doplňkových a objemných krmivech pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) po přečištění extrakcí na pevné fázi (SPE).

Tabulka 1 – Shrnutí koncentračních rozsahů pro PA zkoušené ve společné zkoušce

POZNÁMKA 1 Druhá metoda byla součástí hlavní společné zkoušky pro validaci metody. U této metody se PA‑N‑oxidy redukují přidáním práškového zinku do extraktu krmné suroviny. Následující kroky odpovídají první a hlavní metodě. Kvantitativní výsledky pro každý PA s výjimkou otonecinového typu PA senkirkinu představují součet volné báze PA a jejího odpovídajícího N-oxidu.

POZNÁMKA 2 Vzhledem k nedostatečnému počtu dat pro některé kombinace analytu a matrice nebylo statistické hodnocení pro standardizaci platné. Získaná data naznačila použitelnost metod ve zkušených laboratořích s odpovídajícími opatřeními pro zajištění kvality. Proto je popis této metody zařazen jako informativní příloha (příloha D).

 

 

Konec náhledu - text dále pokračuje v placené verzi ČSN.